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非接觸式超聲在甲基化測序方面的應用

發布時間:2024-10-01 來源:新芝生物 瀏覽量:0
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實驗目的

  為了獲取能與巖沙海葵毒素(Palytoxin,PLTX)特異性結合的天然適配體,目標細胞內提取得到的基因組通過超聲打斷的方式變成 100-300 bp 的 DNA 片段,再通過冷淬的方式獲得折疊后的 ssDNA。將 ssDNA 進行甲基化修飾后進行測序,同時對甲基化修飾后的片段進行親和力測定,最終獲得特異性強、親和力高的天然適配體。

實驗步驟

  HaCaT 和 CHO-K1 細胞基因組 DNA 的提取:

  ①常規培養細胞,待其融合度達到 70% - 80%左右時,吸除原培養基,向每 10 cm2的貼壁細胞中加入 1 mL PBS,用移液槍吹落細胞,轉移至 1.5 mL EP 管中,5000 rpm 離心 5 min,棄上清,加入 200 μL 的 PBS 重懸細胞;

  ②按照 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 說明,加入 180 μL Buffer GB、20 μL Proteinase K 和 10 μL RNase A,充分吹打混勻,于 56℃水浴 10 min;

  ③向裂解液中加入 200 μL 100%乙醇,充分吹打混勻后,將其轉移至已經安置于 Collection Tube 上的 Spin Column 內,12000 rpm 離心 2 min,棄濾液;

  ④將 500 μL Buffer WA 加入至 Spin Column 中,12000 rpm 離心 1 min;

  ⑤將 700 μL Buffer WB 加入至 Spin Column 中,12000 rpm 離心 1 min,并重復 1 次;

  ⑥將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上,12000 rpm 離心 2 min;

  ⑦將 Spin Column 安置于新的 1.5 mL EP 管上,在 Spin Column 膜的中央處加入 50-200 μL 已加熱至 65℃的 Elution Buffer,室溫靜置 5 min;

  ⑧12000 rpm 離心 2 min,洗脫 DNA;

  ⑨使用 NanoDropTM One 進行基因組 DNA 定量。

  片段化基因組 :將提取的基因組 DNA 放置于SCIENTZ08-IIIC非接觸式超聲波細胞粉碎機中,設置功率80%,超聲開時間為 1 s,超聲關時間為 3 s,工作總時間為 150 min,溫度為 15℃,片段化基因組 DNA。

  核酸凝膠電泳 :利用核酸凝膠電泳檢測 DNA 片段的大小,核酸凝膠的配方為:ddH2O 6.69 mL、40%聚丙烯酰胺 1.31 mL、5×TBE 2.4 mL、10%過硫酸銨(Ammonium persulfate,AP)72μL、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)18 μL。在樣品中加入 5×上樣緩沖液,充分混合均勻,將配置好的凝膠放于電泳槽中,加入 1×TBE 電泳緩沖液,垂直拔出梳子,立刻用緩沖液沖洗加樣孔,將樣品緩慢均勻加入孔中,300 V 電泳 20 min,取出凝膠放置于水平搖床,用 Gel-red 染色液避光孵育 20 min,在凝膠成像儀中成像,檢測 DNA 片段大小范圍。

實驗結果

  基因組來源的 ssDNA 文庫的評價

  超聲破碎基因組后,利用核酸凝膠電泳檢測基因組片段大小。如圖所示,DNA 片段長度富集于 200 - 300 bp 之間,當其猝冷變性折疊成單鏈后,ssDNA 長度則集中于 200-300 nt 之間,從 HaCaT 和 CHO-K1 細胞來源的基因組文庫中各取 18 nmol 的 ssDNA 用于后續實驗。

實驗結果

結論

  結論:提取得到的細胞基因組經過超聲打斷后得到 200-300 bp 大小的片段,可直接用于高通量測序,也可重硫酸鹽轉化后用于甲基化測序。

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